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文献精读 组蛋白去甲基化酶KDM6A直接作为氧感受器调控染色体与细胞命运

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原文链接:
https://science.sciencemag.org/content/363/6432/1217.long

知识点积累

氧感受是后生动物的生物学核心,对人类的疾病也有诸多意义。哺乳动物细胞表达多种氧依赖的酶叫做2-氧戊二酸(2-OG)依赖双加氧酶(2-OGDDs),但他们对氧的亲和力以及感受氧的敏感性有很大的不同。其中一种2-OGDD组蛋白去甲基化酶控制着组蛋白的甲基化。缺氧环境使组蛋白甲基化升高,但是这是通过对组蛋白去甲基化酶的直接作用还是间接地通过低氧诱导的HIF转录调控或者2-OG的拮抗分子2-羟戊二酸(2-HG)的作用仍不明了。因此这里作者报道了缺氧直接通过非HIF和2-HG依赖的方式作用于组蛋白的甲基化。作者发现H3K27的去甲基化酶KDM6A/UTX,而非其同源物KDM6B具有氧敏感性。KDM6A的丢失,就如缺氧条件下一般阻滞了H3K27的去甲基化而阻断了细胞的分化。而在缺氧环境下的细胞通过回复H3K27的甲基化稳态重新获得了分化功能。因此,氧气直接影响染色体的调控控制了细胞命运。

氧气在地球大气中的出现是一个重要的分水岭,它创造了后生动物用来感知和响应环境氧变化的保守路径的进化选择压力,这种变化集中表现在异二聚体HIF(低氧诱导因子)转录因子上。在常氧条件下,HIFα亚基的脯氨酸被2-OGDD家族的EglN同工酶羟化。羟基化后的HIF1α被VHL泛素连接酶标记后被降解。而缺氧条件则使EglN同工酶失活因此稳定了HIF1α,并与HIFβ亚基(也称作ARNT)关联并激活促进适应缺氧环境的基因的转录。

2-OGDD家族包括胶原蛋白脯氨酸羟化酶,包含JmjC结构域的组蛋白赖氨酸去甲基化酶(KDMs), TET家族的DNA羟化酶以及至50种的正在研究的其他酶。相较于有高氧气亲和力的胶原蛋白脯氨酸羟化酶,EglNs与氧气的亲和力较低,这也使得他们能感知氧气的生理变化。

已有一些先前的研究表明氧气可以调控组蛋白的甲基化。某些KDM在体外表现出低氧亲和性。并且,许多KDM被缺氧条件及HIF转录激活,也许是为了弥补酶活性的降低。最终,缺氧条件可以导致组蛋白的高甲基化状态。但在这些研究中,组蛋白的高甲基化状态反应的是低氧对KDM直接的作用还是作为低氧或HIF的间接结果仍不清楚。例如,在一些细胞中,低氧会增加左旋羟戊二酸(L-2HG)的产生,这是一种内源的2-OGDD的抑制剂。并且,HIF可以通过许多种途径影响染色质,比如改变KDM的蛋白表达,促进KDM以外的染色质修饰酶(如TETs和DNA甲基转移酶)或上调加强上皮间质转化或表观遗传重编程的相关基因。

实验结果
为了进一步验证缺氧是通过直接还是间接作用于组蛋白甲基化的,作者用慢病毒感染Arnt缺失的小鼠肝癌细胞系(mHeap-1 c4)构建出表达GFP(GFP)或野生型Arnt(WT)或Arnt失活突变(Δ414)的三株细胞(Figure1A)。(N端414对碱基的缺失导致其基本的螺旋-环-螺旋结构域的缺失而不能形成异源二聚化而使HIF功能性失活)。因mHeap-1 c4细胞的持续生长无法耐受作为经典缺氧条件的1%氧气浓度,因此作者选用了较为温和的低氧条件(2-5%)。正如预期的,经典的HIF靶基因如(Egln3 和 Ndrg1)的表达在WT细胞中被诱导增加而在GFP和突变细胞内则未能被诱导(Figure S1D)。

接着,作者通过多重质谱定量分析再三株细胞中组蛋白甲基化在缺氧条件下的改变,组蛋白修饰模式的无监督聚类分析表明,细胞系的聚集主要基于细胞生长期间的氧气供应状态而非HIF的状态(Figure 1B)。与已有报道结果相一致的是,缺氧促进了H3K4,H3K9,H3K27的二甲基化与三甲基化(Figure 1B)。H3K9与H3K27的高甲基化状态通过WB被验证(Figure 1C)。同时作者也观察到H3K27的低甲基化状态(me0或me1)及H3K27乙酰化状态的减少(Figure 1B),这跟已有的认知即组蛋白的甲基化与乙酰化状态被相反调节相一致。H3K27的高甲基化不能被EZH2(H3K27的主要甲基转移酶)表达的增加及主要的去甲基化酶KDM6A (也称作UTX)或KDM6B的表达减少所解释(Figure S2).并且,缺氧同样能促进VHL确实的RCC4细胞组蛋白的高甲基化。因此,缺氧无论是在无法产生HIF应答的细胞(mHeap-1 c4)或持续过表达HIF的细胞(RCC4)中都能促进组蛋白的高甲基化,这使作者认为缺氧引起的组蛋白高甲基化不是由HIF活性变化引起的。

作者接着探索了在mHeap-1c4中缺氧引起的组蛋白高甲基化是否由代谢物的变化引起的,如增加的L-2HG或减少的2-OG可抑制KDM的活性。作者发现在上述的三株同基因细胞中(GFP,WT,Δ414),5%的氧气环境没有明显增加2-HG的总量或对映异构体(Figure S4A-C)但确实增加了2-OG的水平(Figure S4D)。即使在更极端的缺氧条件下2-HG的含量有所升高,但远低于能引起组蛋白甲基化改变的水平(Figure S4E-H)。

缺氧可以刺激活性氧(ROS)的产生,而对OGDDs产生抑制作用。用ROS诱导剂叔丁基过氧化氢处理mHepa-1 c4细胞,发现诱导组蛋白甲基化所需的细胞内ROS水平是2%氧气处理后的10倍(FigureS5)。以上这些结果表明低氧作用于KDM活性的非HIF依赖方式也不是通过L-2HG的增加,2-OG的减少或者ROS的增加,而是对一些特定的KDM酶活性的直接影响。

为了支持这一假设,作者发现重组蛋白KDM4B,KDM5A和KDM6A有与EglN家族相似的低氧亲和力,而重组的KDM4A,KDM5B,KDM5CKDM5D及KDM6B有高氧亲和力(Figure S6-S8)。同全场蛋白一样,从KDM6A分离的催化域相较于KDM6B的对应结构域有较低的氧亲和力。(Figure 1D-F, FigureS8 )

作者决定主要研究KDM6基于一下理由:缺氧和H3K27甲基化已与细胞分化独立地联系起来;这个组蛋白标记可被药物操控;KDM6A是迄今发现与氧气亲和力最低地KDM。作者首次在293T,MCF7和SK-N-BE人类细胞系中确立了缺氧诱导H3K27的甲基化(Figure S9)。并且,组织学分析显示H3K27甲基化升高的小鼠组织都是处于缺氧环境,如肾脏、脾脏生发中心及胸腺。而在富氧的组织如心脏中则不升高(Figure 1G)。同样的,H3K27甲基化在肿瘤的缺氧区域升高(Figure S10)。最终,GSEA分析2000多例基于HIF相关基因的常氧及低氧状态肿瘤标本显示缺氧环境下的肿瘤具有H3K27高甲基化的转录特征(Figure S11)。

为了探索缺氧对体外细胞分化的影响,作者以C2Cl2鼠成肌细胞为研究对象。当从富含血清的生长培养基(GM)转移到营养分化不良的分化培养基(DM)时,C2Cl2细胞能分化成肌球蛋白重链(MyHC)阳性多核肌管。而缺氧阻滞了C2Cl2的分化(Figure S12A-D),缺氧环境下的C2Cl2细胞在DM中进入静息样状态,但当回复到GM的常氧条件下时相对对照更易增殖(Figue S12E-G)。同样地,缺氧组织了MEF细胞地成肌分化。

C2Cl2细胞内用CRISPR-Cas9敲除ARNT能阻滞其在常氧条件下的分化(FigureS14A-C),但也无法挽救在缺氧条件下的分化能力(Figure S14D)。并且常氧状态下稳定表达HIF1α或HIF2α不能阻滞其分化(Figure S14E-F)。因此,在C2Cl2细胞中产生的缺氧阻滞分化不是由于HIF的激活。

同时在用2%氧气处理C2Cl2细胞时,2-HG的总量没有增加,L-2HG只升高了2倍(Figure S15A-C)。而通过药物或基因学的改变使细胞内L-2HG的含量高出3-5倍时仍能使C2Cl2细胞在低氧条件下分化(Figure S15D-G)。因此,2-HG也不是低氧引起细胞分化阻滞的原因。

当用KDM6家族的抑制剂GSK-J4处理C2Cl2时,促进了H3K27的高甲基化及阻滞了其分化(Figure S16)。反之,KDM-C70,这一KDM5家族的抑制剂则不能阻断C2Cl2细胞的分化(Figure S17)。如前文所述,KDM6A和KDM6B对氧亲和力的差异导致了其介导缺氧产生的H3K27甲基化以及分化阻滞主要由KDM6A的活性丢失引起。用shRNA敲减KDM6A能重现缺氧导致的分化表型(Figure2 A-B)。并且CRISPR-Cas9敲除KDM6A阻滞了其分化能力并由sgRNA耐受的KDM6A cDNA回复(Figure 2C-E)。而KDM6B的敲除则没有效果以及KDM5A的敲除反而促进分化。而H3K27的三甲基化在KDM6A缺失的C2Cl2细胞中是氧不敏感的。这与在同源基因中,KDM6A是主要的氧传感器的结论相一致(Figure 2F)。

已有的研究工作认为KDM6A直接被募集到肌源分化的靶基因上。因此作者探究了是否分化程序的启动是由KDM6A介导的H3K27三甲基化的减弱依赖的。通过比较常氧状态下C2Cl2细胞分别在GM和DM中的转录特征发现了在肌肉特异性靶基因的差异较大(Figure 2G)。但是,缺氧(能引起分化阻滞)减弱了这两种情况之间的转录差异(FigureS20A),这与这些细胞无法诱导DM中的肌肉特异性标记有关(Figure 2G, Figure S20B)。H3K27me3状态通常会抑制转录。缺氧条件下,因为KDM6A的失活,在DM中生长的C2C12细胞无法激活晚期成肌基因(例如Actc,Myl1和Myog),这与在这些基因座上擦除H3K27me3的失败有关(Figure2H-J, Figure S21)。并且这是具有特异性的,因为在缺氧条件下,晚期成肌基因中H3K4me3降低了(Figure S21)。

Figure S20

细胞失去分化能力是肿瘤的标志之一,KDM6A是一个抑癌基因,在多种肿瘤包括白血病,肾癌和膀胱癌中失活。GSEA分析显示一个肌原分化相关的基因集的表达在KDM6A WT中比KDM6A突变的膀胱癌中表达增高(Figure S22)。这些数据提示缺氧环境诱导下的KDM6A失活促进了H3K27三甲基化的持续存在而阻滞了分化相关基因的转录重编程。如果这个假设成立,那么缺氧对于细胞分化的影响应该能在H3K27的甲基转移酶活性被抑制后所逆转(Figure 3A)。CRISPR-Cas9及EZH2抑制剂抑GSK126抑制EZH2后减少了H3K27三甲基化水平并部分回复了C2Cl2细胞在缺氧状态下的分化能力(Figure 3B)。

最后,作者通过尝试直接增加KDM6A的氧亲和力。作者推断,KDM6A和KDM6B催化区域中的某些非保守残基导致了它们的氧亲和力的巨大差异。作者将已发表的KDM6A和KDM6B的催化域JmjC模型重叠,注意到两个非保守残基,M1190 (KDM6A) →T1434 (KDM6B) 和 E1335 (KDM6A)→ D1579 (KDM6B),嵌在2OG和亚铁离子的连接口袋内(Figure3C)。正如预测的那样,一个KDM6A的变异体(包含了这两个KDM6B样的变化)展现出高于野生型KDM6A 2倍的氧亲和力(Figure 3D-E)。野生型和MT/ED变异的KDM6A都能回复KDM6A缺失的C2Cl2细胞在常氧环境下的分化能力,但在缺氧环境下,突变体KDM6A展现了明显优于野生型KDM6A回复分化的能力,这又可能就是由于其氧气亲和力的增强(Figure 3F-G)。

总结与思考

已有的研究表明,氧气和H3K27甲基化都展现出调节胚胎发育、细胞分化、干性和恶性转化的功能。但作者认为这两者之间可能是存在联系的。氧对染色质有直接或间接的作用,如涉及到组蛋白修饰的酶如KDM6A,它将氧的亲和力变化与H3K27甲基化的变化以及细胞命运的转录调控结合起来。

根据作者的数据看到在Arnt缺失的mHepa-1 c4细胞中仍能观察到H3K4和H3K9高甲基化的状态,推测至少有一种H3K4和H3K9的去甲基化酶扮演着氧感受器的角色。结合本文的生化数据及已有的研究认为KDM5A可能有这样的功能。同样的,深度缺氧也可抑制其他2-OG依赖的酶,如TETs, 导致DNA的高甲基化。甚至影响m6A去甲基化酶导致RNA甲基化的改变也未可知。

哺乳动物胚胎发育发生在缺氧环境中,哺乳动物干细胞维持在缺氧环境中。缺氧可以通过激活HIF和HIF靶基因如Oct4等来影响干性和细胞分化。这些作用与氧对组蛋白甲基化的直接作用并不相互排斥,可能相互加强。缺氧促进在后生动物和植物中的干性形成,但HIF途径仅存在于前者。由此推测组蛋白去甲基化酶对氧的感觉可能先于氧敏感转录因子的出现。


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